NC最新成果:上交大張志剛團隊發現胰腺癌肝轉移免疫抑制微環境形成新機制

來源: 上海吉凱基因化學技術有限公司   2021-1-29   訪問量:671評論(0)

中性粒細胞是人體血液中含量最多的免疫細胞,以往通常認為中性粒細胞作為一種均質性的細胞參與了機體的抗感染免疫反應,而近年來的研究發現中性粒細胞具有豐富的異質性,中性粒細胞既能表現出免疫促進的N1表型又能表現出具有免疫抑制的N2表型,異質性的中性粒細胞在天然免疫反應和適應性免疫反應中均發揮了重要作用,但目前介導中性粒細胞免疫異質性的機制尚不清楚。


2021年1月8日,上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院上海市腫瘤研究所張志剛團隊與上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院膽胰外科孫勇偉團隊合作在Nature Communications雜志(2019年影響因子12.121,5年影響因子13.61)在線發表了題為“Identification of a subset of immunosuppressive P2RX1-negative neutrophils in pancreatic cancer liver metastasis”的研究論文。


該研究發現了胰腺癌肝轉移免疫微環境中富含ATP受體P2RX1陰性(P2RX1-)的中性粒細胞,而正常肝臟中以P2RX1陽性(P2RX1+)的中性粒細胞為主。P2RX1-和P2RX1+中性粒細胞表現出了代謝和免疫學表型的異質性,P2RX1-中性粒細胞線粒體代謝增強,高表達PD-L1、Arg1等免疫抑制分子;P2RX1+中性粒細胞糖酵解代謝增強,高表達TNF-α、IL1-α等免疫促進分子。胰腺癌肝轉移微環境中的P2RX1-中性粒細胞過表達PD-L1,抑制了殺傷性CD8+T細胞的細胞毒活性,運用PD-L1或者PD-1單抗均有效恢復了殺傷性CD8+T細胞的細胞毒活性。機制研究表明,P2RX1-中性粒細胞高表達轉錄因子Nrf2,Nrf2介導了P2RX1-中性粒細胞代謝表型和免疫表型的轉變。

研究結果

為了研究胰腺癌肝轉移過程中免疫微環境的變化,作者對數據庫中胰腺癌原位、癌旁、肝轉移和轉移旁4個組織的大體切割標本進行了轉錄組分析。差異分析結果顯示不同組織之間轉錄組改變明顯,為了進一步探討免疫微環境的差異,作者對26種免疫細胞圖譜進行了分析,結果顯示各個組織中免疫細胞圖譜差異明顯,其中肝轉移組織中參與抗腫瘤免疫的activated CD8+、central memory CD8+、effector memory CD8+ 和T helper type 1 (Th1) 細胞數量最低,而通常認為的與促腫瘤相關的Th2細胞數量則較高,提示肝轉移組織處于免疫抑制狀態。


作者發現胰腺癌肝轉移組織中嘌呤能信號通路相關的基因表達失調,Veen圖結果顯示胰腺癌嘌呤能信號分子表達發生了顯著的改變,其中ADORA2B位于上調基因的交集,而P2RX1位于下調基因的交集。ADORA2B屬于P1嘌呤能信號受體,是經典的參與免疫抑制的嘌呤能受體, ADORA2B表達的上調與抗腫瘤免疫細胞浸潤呈負相關;與之相反,P2RX1表達的下調與抗腫瘤免疫細胞浸潤呈正相關,這提示P2RX1可能參與了抗腫瘤免疫反應。

圖1.P2RX1與臨床胰腺癌肝轉移中的免疫抑制微環境有關


為了進一步探討P2RX1缺失促進胰腺癌肝轉移的機制,作者對WT和P2rx1-/-小鼠正常肝組織day 0(D0)和day 3(D3)、day 17(D17)肝轉移組織進行了RNA-seq。通過對結果進行分析,作者發現WT和P2rx1-/-小鼠免疫耗竭相關基因的表達,結果與臨床轉錄組數據的結果一致,P2rx1-/-小鼠肝轉移組織Pdcd1(PD-1)、Cd274(PD-L1)、Lag3等基因表達上調顯著,這些結果表明,P2RX1表達缺失促進胰腺癌肝轉移可能與免疫耗竭有關。


圖2.WT和P2rx1-/-小鼠在D3和D17時肝轉移中免疫檢查點分子的熱圖分析比較


接下來,作者運用流式細胞術檢測了肝轉移小鼠模型中PD-1及其配體PD-L1、PD-L2和CTLA-4及其配體CD80、CD86免疫耗竭分子表達,結果顯示,P2rx1-/-小鼠CD8+T細胞PD-1和CTLA-4表達升高,提示處于較高的免疫耗竭狀態。與P2RX1+中性粒細胞相比,WT小鼠中的P2RX1-中性粒細胞和P2rx1-/-小鼠中的中性粒細胞表達較高的PD-L1和CD86,各組中性粒細胞均不表達PD-L2和CD80,與CD86相比,P2RX1-和P2rx1-/-中性粒細胞PD-L1的表達更強,因此流式的結果提示P2RX1表達缺失引起的PD-L1上調可能參與了胰腺癌肝轉移免疫抑制微環境形成。


為了明確P2RX1-中性粒細胞對抗腫瘤免疫的抑制作用,作者在體外進行了共培養實驗。OT1細胞為TCR轉基因的CD8+T細胞,可特異性地識別卵清蛋白(OVA)來源的抗原肽SIINFEKL,將OVA慢病毒導入KPC細胞后制作可被OT1細胞識別并殺傷的胰腺癌細胞(KPC-OVA),體外共培養實驗證實了活化的OT1細胞對KPC-OVA細胞具有明顯的細胞毒作用,而對空載慢病毒導入的KPC細胞(KPC-LV)無明顯的殺傷。


接下來,作者進一步研究了WT和P2RX1-中性粒細胞對OT1細胞殺傷KPC-OVA細胞的影響,體外共培養結果顯示與WT中性粒細胞相比,P2RX1-中性粒細胞更加明顯地抑制了OT1細胞的細胞毒作用,anti-PD-L1單抗的運用則部分恢復了OT1細胞的細胞毒作用。這些結果表明P2RX1-中性粒細胞表達的PD-L1可直接抑制胰腺癌的抗腫瘤免疫。

圖3.P2RX1-中性粒細胞通過高表達PD-L1抑制胰腺癌抗腫瘤免疫


研究結論

1. 胰腺癌肝轉移中嘌呤能信號受體P2RX1陰性(P2RX1-)中性粒細胞亞群浸潤增多;


2. P2RX1-中性粒細胞通過表達PD-L1等免疫抑制分子介導胰腺肝轉移免疫抑制微環境。


吉凱助力

本研究中用到的OVA過表達慢病毒為吉凱基因提供,用于感染KPC細胞,MOI 50。在體外共培養實驗中過表達OVA抗原的小鼠胰腺癌KPC細胞可被活化的殺傷性CD8+OT1細胞識別,是研究腫瘤特異性殺傷性CD8+T細胞的重要工具。


作者簡介


上海交通大學王旭、胡立鵬、秦魏婷、楊琴和江蘇大學附屬醫院陳德玉為本文的共同第一作者,上海交通大學張志剛、張雪莉、蔣書恒和孫勇偉為本文的通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金、上海市自然科學基金和上海市衛生計劃委員會的資助。


張志剛,博士,研究員。2003年畢業于中科院遺傳與發育生物學研究所,獲博士學位。2003年至2009年在德國科隆大學醫學院生化研究所博士后,2009年10月以人才引進方式來上海市腫瘤研究所癌基因及相關基因國家重點實驗室工作,現任神經遞質與腫瘤微環境研究組組長。中國生理學會基質生物學專業委員會主任委員,中國醫師協會精準醫療委員會癌癥代謝與治療委員會副主任委員。已獲得國家自然科學基金重大研究計劃、國家自然科學基金面上項目、十二五國家重大專項、國家高技術研究發展計劃(863計劃)、上海市教委科研創新項目、上海交通大學“醫工交叉研究基金”等課題資助。已發表SCI論文60多篇,以通訊作者在國際著名雜志Gastroenterology(2篇), Gut,Hepatology,Journal of Hepatology,Clincal Cancer Research,Cancer Research,Oncogene等發表多篇論文。上海市優秀學科帶頭人,上海市衛生系統優秀學科帶頭人,上海交通大學醫學院“高原高峰”計劃。申請國家發明專利9項,獲國家專利授權6項,獲國際PCT專利授權1項, 參與編寫中英文專著2本。獲上海醫學科技二等獎(第一完成人)。Science子刊Metabolism Discovery雜志副主編。


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