WB實驗小貼士丨選擇“麗春紅”還是“考馬斯亮藍”染料?

來源: Cell Signaling Technology (CST)   2021-2-1   訪問量:415評論(0)


當裂解物樣品經過 SDS-PAGE 電泳過程,準備轉移到膜上以進行蛋白質印跡檢測。但如果不這樣做呢?

試想一下,如果經過完整的實驗步驟后,您的條帶不在您期望的范圍內,則可能需要對抗體進行故障排除,但還應該對電泳和轉移步驟進行故障排除。其實,可以在轉膜或電泳后通過用 Ponceau S(麗春紅) 或考馬斯亮藍染色來觀察總蛋白遷移的情況。


1) Ponceau S & 考馬斯亮藍


Ponceau S 染色液和考馬斯亮藍染色可實現電泳后蛋白質轉移的可視化。它們對于確認蛋白質轉移、目標靶點的存在以及節省時間、實驗樣本非常重要。此外,它們能顯示出印跡中任何瑕疵(例如氣泡、轉印不均勻)。

 

2) 選擇哪一種染料?

 

Ponceau S 和考馬斯亮藍染色都是帶負電的溶液,它們與帶正電的氨基酸基團和非極性蛋白區域結合。

 

膜和蛋白水平

 

Ponceau S 檢測到的蛋白質水平為 200 ng 以上,與 PVDF、硝化纖維或尼龍膜兼容。傳統的考馬斯亮藍僅與 PVDF 膜兼容,但可以檢測 50 ng 及以上的蛋白質。染色靈敏度高可能很重要,但也要看具體的樣品類型和進行的檢測。

 

使用考馬斯亮藍溶液就不能繼續進行蛋白質印跡分析。這是因為溶液中存在的醇和酸會在使用后將蛋白質樣品固定在凝膠中。Ponceau S 染色液不能固定蛋白質,因此可以在染色后進行蛋白質印跡分析。

 

實驗時長

 

可用的考馬斯亮藍染色溶液有幾種類型,并且實驗步驟略有不同,時間上從兩個小時到一整天不等。最常用的一種考馬斯亮藍 G-250 可以按以下方式使用:電轉移后,用 ddH2O 洗滌聚丙.烯酰胺凝膠 3 次。在聚丙.烯酰胺凝膠上添加至少 25mL(或直到凝膠被覆蓋)染色溶液。將帶有染色溶液的凝膠放在搖床上,并緩慢攪拌,以防止凝膠粘附到容器上。染色時間取決于凝膠厚度和丙.烯酰胺的百分比?赡苄枰獌蓚小時或更長時間才能在凝膠上看到均勻的藍色。凝膠染色后,用 ddH2O 洗滌凝膠,并輕輕搖動一到兩個小時,換幾次 ddH2O 以去除多余的游離染料。

 

Ponceau S 染色實驗步驟大約需要 20 分鐘,并且無毒,并且比考馬斯亮藍更溫和。使用 Ponceau S (CST #59803) 可以按以下方式使用:總蛋白經過電轉移到膜上后,在 ddH2O中短暫沖洗膜,室溫下在 Ponceau S 染色液中孵育膜 5~10 分鐘,然后在 ddH2O 中沖洗膜 1~5 分鐘,直至可見紅色條帶。然后可以用 1X TBS-T 沖洗五分鐘,然后在沖洗膜之前對條帶進行標記或拍照。之后可以繼續進行實驗,并且Ponceau S 的所有殘留物會在封閉步驟中被洗去 。此外,Ponceau S 不會與抗體結合相互作用。

 

總體而言,兩種實驗步驟都可以幫助確保您的結果。 如果您需要檢測 50-200 ng 范圍內的蛋白質,則考馬斯亮藍是您的最佳選擇。但是,在 CST,我們通常首.選Ponceau S,因為它速度快、易用、柔和而有效。

 

其他資源,供您學習:

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5445784/
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2429581/
https://advansta.com/seeing-blue-red-coomassie-vs-ponceau-staining/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5646381/

僅供研究使用。不得用于診斷流程。

 



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